層析法利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)間的差異（溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附能力、分子親合力等），使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。
層析法進(jìn)行時(shí)有兩個(gè)相，一個(gè)相稱(chēng)為固定相，另一相稱(chēng)為流動(dòng)相。由于各組分所受固定相的阻力和流動(dòng)相的推力影響不同，各組分移動(dòng)速度也各異，從而使各組分得到分離。
層析技術(shù)與待分離混合物中各組分的理化性質(zhì)（分子自然形狀、大小、獲電狀態(tài)、溶解度與選擇性吸附劑或載體物的吸附能力，分配系數(shù)、酸堿環(huán)境、溫度、極性以及分子的親和能力等）有著直接關(guān)系。除此，任何層析技術(shù)，均具有兩相條件，造成流動(dòng)相對(duì)固定相作單向相對(duì)運(yùn)動(dòng)。這種流動(dòng)相推動(dòng)樣品中各組分通過(guò)固定相向前遷移，其運(yùn)動(dòng)速率與兩相物質(zhì)和被分離物質(zhì)狀態(tài)有關(guān)。由于被分離物各組分中的理化性質(zhì)不同，對(duì)不同的兩組或兩組以上組分，具有不同的作用力，通過(guò)吸附一解吸，或離子交換、分子篩效應(yīng)、靜電引力，免疫特異性吸附等，造成各組間生物分子分離、遷移距離不等，最終達(dá)到被測(cè)物的分離、純化的目的。這一技術(shù)的應(yīng)用，不但能分離有機(jī)化合物，還能分離無(wú)機(jī)物，更主要的是適合于分離分析生物高分子物質(zhì)，其分離范圍廣，適用性強(qiáng)。化學(xué)性穩(wěn)定、靈敏度高，既可純化又可制備，條件簡(jiǎn)便。
層析法分類(lèi)如下：
1.凝膠層析
又稱(chēng)分子篩過(guò)濾或排阻層析等。固定相是多孔凝膠，各組分的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度（移動(dòng)速度）也不同。
優(yōu)點(diǎn)：所用凝膠屬于惰性載體，吸附力弱，操作條件溫和，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很好的分離效果。
常用的凝膠有Sephadex G（葡聚糖凝膠）系列。凝膠層析可用于脫鹽、分離提純、測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量、高分子溶液的濃縮等。
2.離子交換層析
采用具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆交換的性質(zhì)來(lái)分離離子型化合物的方法。主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其他帶電荷的生物分子。
3.高效液相層析
在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進(jìn)氣相層析的理論而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新穎快速的分離技術(shù)。具有分離能力強(qiáng)、測(cè)定靈敏度高、可在室溫下進(jìn)行、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)分離蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類(lèi)固醇和類(lèi)脂等尤其有利。根據(jù)流動(dòng)相和固定相相對(duì)極性，高效液相色譜分析可分為正相和反相兩種。
4.親和層析
利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達(dá)到分離的目的。將可親和的一對(duì)分子中的一方以共價(jià)鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含混合組分的樣品通過(guò)此固定相時(shí)，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)才能被固定相吸附結(jié)合，無(wú)關(guān)組分隨流動(dòng)相流出。親和層析中所用的載體稱(chēng)為基質(zhì)，與基質(zhì)共價(jià)連接的化合物稱(chēng)配基。具有專(zhuān)一親和力的生物分子對(duì)主要有：
抗原與抗體，DNA與互補(bǔ)DNA或RNA，酶與底物，激素與受體，維生素與特異結(jié)合蛋白，糖蛋白與植物凝集素等。親和層析可用于純化生物大分子、稀釋液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏、分離核酸等。
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